Pesquisadores estudam código genético de fungo patogênico para compreender sua capacidade de infecção e propor terapias
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Pesquisadores estudam código genético de fungo patogênico para compreender sua capacidade de infecção e propor terapias
Título original da pesquisa
Epidemiologia de Cryptococcus neoformans: aspectos moleculares
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Resumo
O estudo traz a contribuição para a caracterização genética da espécie e, conseqüentemente, para um maior conhecimento da variabilidade fenotípica, ou seja, da variabilidade que ocorre entre grupos da mesma espécie que apresentam características exteriores.
O que é a pesquisa?
A criptococose é uma doença sistêmica (um tipo de doença onde ocorre disseminação pelo organismo, com diferentes órgãos sendo atingidos), causada por um fungo, o Cryptococcus neoformans. A doença ataca os órgãos profundos e a pele, com principal tropismo, ou seja, predileção, pelo sistema nervoso central. Esse fungo é uma levedura oportunista (ou seja, desenvolve-se mais quando o sistema imunológico dos pacientes está mais fraco) e embora possa também infectar indivíduos em boas condições de saúde, tornou-se mais freqüente a partir da década de 1980 com o aumento da população de imunossuprimidos (como os portadores de AIDS, cuja imunidade é menor).
Tendo em vista a importância clínica e epidemiológica das variedades de Cryptococcus neoformans, pesquisadores do Laboratório de Biologia de Fungos de Importância Médica e Biotecnológica, do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, iniciaram estudos epidemiológicos, desde 1999, no sentido de caracterizar as variedades existentes deste fungo, utilizando métodos que analisam seu código genético e diagnosticam as variedades, além de buscarem novas fontes ambientais (isto é, focos de contaminação no ambiente) para isolamento e estudo.
Pretende-se, assim, contribuir para a caracterização genética da espécie e, conseqüentemente, para um maior conhecimento da variabilidade fenotípica, ou seja, da variabilidade que ocorre entre grupos da mesma espécie que apresentam características exteriores iguais, porém geneticamente diferentes. Esta variabilidade pode gerar diferentes formas de estruturação, surgindo assim diferentes variações morfológicas no organismo. Esta caracterização genética também considerará aspectos epidemiológicos, morfológicos e bioquímicos desta espécie.
Nos últimos quatro anos de pesquisa foi estruturada uma coleção com 105 isolados clínicos e 19 ambientais (obtidos de excrementos de pombos e de Eucalyptus spp.) coletados no Estado do Rio Grande do Sul.
Esses isolados foram caracterizados com base em dados morfológicos, bioquímicos e moleculares gerando duas dissertações de mestrado, uma tese de doutorado e quatro artigos científicos publicados em periódicos especializados, além da participação no projeto mundial de epidemiologia de Cryptococcus neoformans, coordenado pelo Dr. Wieland Meyer, na Austrália.
Os objetivos específicos da pesquisa em curso são:
1.isolar e caracterizar C. neoformans a partir de potenciais reservatórios ambientais ainda não conhecidos no Rio Grande do Sul, verificando a predileção do fungo por material fecal de uma ou outra espécie de ave;
2.propor uma forma de diagnóstico direto através de um teste conhecido por reação em cadeia da polimerase (PCR) em pacientes com sintomas de criptococose; e
3.identificar, através de um método denominado Análise de Diferença Representacional (RDA), as diferenças de código genético das variedades de C. neoformans var. grubbi e C. neoformans var. gattii.
Para alcançar estes três objetivos os pesquisadores propõem-se a:
1.Obter isolados do fungo em excretas de diferentes aves de reservatórios inexplorados no Rio Grande do Sul, aumentando a quantidade de isolados ambientais de diferentes nichos ecológicos;
2.Validar o teste diagnóstico proposto no Laboratório Central do Instituto de Pesquisas Biológicas da Secretaria do Meio Ambiente do Estado do Rio Grande do Sul (LACEN); e
3.Encontrar algumas diferenças no código genético das duas variedades contribuindo para a caracterização genética da espécie e, conseqüentemente, para um maior conhecimento da variabilidade fenotípica.
Tendo em vista a importância clínica e epidemiológica das variedades de Cryptococcus neoformans, pesquisadores do Laboratório de Biologia de Fungos de Importância Médica e Biotecnológica, do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, iniciaram estudos epidemiológicos, desde 1999, no sentido de caracterizar as variedades existentes deste fungo, utilizando métodos que analisam seu código genético e diagnosticam as variedades, além de buscarem novas fontes ambientais (isto é, focos de contaminação no ambiente) para isolamento e estudo.
Pretende-se, assim, contribuir para a caracterização genética da espécie e, conseqüentemente, para um maior conhecimento da variabilidade fenotípica, ou seja, da variabilidade que ocorre entre grupos da mesma espécie que apresentam características exteriores iguais, porém geneticamente diferentes. Esta variabilidade pode gerar diferentes formas de estruturação, surgindo assim diferentes variações morfológicas no organismo. Esta caracterização genética também considerará aspectos epidemiológicos, morfológicos e bioquímicos desta espécie.
Nos últimos quatro anos de pesquisa foi estruturada uma coleção com 105 isolados clínicos e 19 ambientais (obtidos de excrementos de pombos e de Eucalyptus spp.) coletados no Estado do Rio Grande do Sul.
Esses isolados foram caracterizados com base em dados morfológicos, bioquímicos e moleculares gerando duas dissertações de mestrado, uma tese de doutorado e quatro artigos científicos publicados em periódicos especializados, além da participação no projeto mundial de epidemiologia de Cryptococcus neoformans, coordenado pelo Dr. Wieland Meyer, na Austrália.
Os objetivos específicos da pesquisa em curso são:
1.isolar e caracterizar C. neoformans a partir de potenciais reservatórios ambientais ainda não conhecidos no Rio Grande do Sul, verificando a predileção do fungo por material fecal de uma ou outra espécie de ave;
2.propor uma forma de diagnóstico direto através de um teste conhecido por reação em cadeia da polimerase (PCR) em pacientes com sintomas de criptococose; e
3.identificar, através de um método denominado Análise de Diferença Representacional (RDA), as diferenças de código genético das variedades de C. neoformans var. grubbi e C. neoformans var. gattii.
Para alcançar estes três objetivos os pesquisadores propõem-se a:
1.Obter isolados do fungo em excretas de diferentes aves de reservatórios inexplorados no Rio Grande do Sul, aumentando a quantidade de isolados ambientais de diferentes nichos ecológicos;
2.Validar o teste diagnóstico proposto no Laboratório Central do Instituto de Pesquisas Biológicas da Secretaria do Meio Ambiente do Estado do Rio Grande do Sul (LACEN); e
3.Encontrar algumas diferenças no código genético das duas variedades contribuindo para a caracterização genética da espécie e, conseqüentemente, para um maior conhecimento da variabilidade fenotípica.
Como é feita a pesquisa?
Os primeiros estudos de Cryptococcus identificaram duas variedades desse fungo: a C. neoformans var. neoformans (que estaria presente nos sorotipos que consiste na caracterização de um microrganismo pela identificação de seus antígenos, como A, AD e D) e a C. neoformans var. gattii (nos sorotipos B e C).
Entretanto, estudos internacionais recentes sugerem uma nova classificação: o sorotipo A pertenceria à variedade C. neoformans var. grubii, predominantemente isolada em fezes de aves e que tem maior importância clínica, pois um maior número de indivíduos está infectada por esta variedade. Os sorotipos B e C, pertencentes à variedade C. neoformans var. gattii, são mais importantes para pacientes imunocompetentes (isto é, cujo sistema imunológico não apresenta enfraquecimento). Finalmente, o sorotipo D, seria o pertencente à variedade C. neoformans var. neoformans, tendo importância para pacientes imunossuprimidos, e também isolado de fezes de aves. A classificação do sorotipo AD é controversa, e este sorotipo não é mencionado nessa nova classificação. Tem-se sugerido que este sorotipo seja resultado de cruzamento genético entre os sorotipos A e D.
No estado do Rio Grande do Sul esta última variedade já foi isolada de árvores de eucalipto. Devido às diferenças já conhecidas nas manifestações clínicas e nichos ecológicos entre as variedades de C. neoformans, supõe-se que as variedades são espécies geneticamente próximas, mas diferentes, como vem sendo amplamente debatido. C. neoformans var. gattii afeta tipicamente indivíduos aparentemente saudáveis, e a doença causada por este é distinta da doença devida ao C. neoformans var. neoformans por uma incidência maior de criptococomas – lesões maciças – no pulmão e no cérebro, aumento da morbidade neurológica e uma resposta diminuída aos remédios antifúngicos. As variedades grubii e neoformans são mais comumente encontradas em solo misturado com fezes de aves, principalmente pombos. Já a variedade gattii é mais comumente encontrada em árvores, principalmente eucaliptos (Eucalyptus spp.).
A utilização de técnicas moleculares tem auxiliado na compreensão da epidemiologia e das características patogênicas (isto é, de infestação) de C. neoformans e dos organismos patogênicos (isto é, causadores de doenças, também chamados patógenos) de forma geral.
Estas metodologias têm demonstrado que existe uma ampla variação genética entre os isolados clínicos e os ambientais de C. neoformans (isto é, entre as amostras colhidas no ambiente e as obtidas em condições laboratoriais). A existência de variabilidade genética entre os isolados de um determinado patógeno é importante porque pode traduzir-se em diferenças na virulência (capacidade de infecção) ou na suscetibilidade aos agentes terapêuticos (medicamentos).
A análise das diferenças entre dois códigos genéticos complexos tem grande importância para a descoberta e a caracterização dos agentes infecciosos. Contudo, quanto maior e mais complexos os códigos genéticos, ou quanto menor a diferença entre eles, mais difícil se torna a identificação das diferenças.
Nesta pesquisa é utilizada a técnica molecular denominada Análise de Diferença Representacional (RDA), que detecta diferenças que resultam em pequenos fragmentos do código genético, presentes em uma população dos fungos e ausentes em outra.
Nessa técnica os dois códigos genéticos são simplificados, por assim dizer, em pequenos fragmentos, que podem então ser comparados. Ao ser repetida várias vezes, sobre as seqüências de DNA em estudo, a técnica amplifica as diferenças a níveis que podem ser facilmente detectados. As seqüências diferenciadas são então clonadas de modo que as diferenças existentes entre os genomas (códigos genéticos) possam ser confirmadas.
Entretanto, estudos internacionais recentes sugerem uma nova classificação: o sorotipo A pertenceria à variedade C. neoformans var. grubii, predominantemente isolada em fezes de aves e que tem maior importância clínica, pois um maior número de indivíduos está infectada por esta variedade. Os sorotipos B e C, pertencentes à variedade C. neoformans var. gattii, são mais importantes para pacientes imunocompetentes (isto é, cujo sistema imunológico não apresenta enfraquecimento). Finalmente, o sorotipo D, seria o pertencente à variedade C. neoformans var. neoformans, tendo importância para pacientes imunossuprimidos, e também isolado de fezes de aves. A classificação do sorotipo AD é controversa, e este sorotipo não é mencionado nessa nova classificação. Tem-se sugerido que este sorotipo seja resultado de cruzamento genético entre os sorotipos A e D.
No estado do Rio Grande do Sul esta última variedade já foi isolada de árvores de eucalipto. Devido às diferenças já conhecidas nas manifestações clínicas e nichos ecológicos entre as variedades de C. neoformans, supõe-se que as variedades são espécies geneticamente próximas, mas diferentes, como vem sendo amplamente debatido. C. neoformans var. gattii afeta tipicamente indivíduos aparentemente saudáveis, e a doença causada por este é distinta da doença devida ao C. neoformans var. neoformans por uma incidência maior de criptococomas – lesões maciças – no pulmão e no cérebro, aumento da morbidade neurológica e uma resposta diminuída aos remédios antifúngicos. As variedades grubii e neoformans são mais comumente encontradas em solo misturado com fezes de aves, principalmente pombos. Já a variedade gattii é mais comumente encontrada em árvores, principalmente eucaliptos (Eucalyptus spp.).
A utilização de técnicas moleculares tem auxiliado na compreensão da epidemiologia e das características patogênicas (isto é, de infestação) de C. neoformans e dos organismos patogênicos (isto é, causadores de doenças, também chamados patógenos) de forma geral.
Estas metodologias têm demonstrado que existe uma ampla variação genética entre os isolados clínicos e os ambientais de C. neoformans (isto é, entre as amostras colhidas no ambiente e as obtidas em condições laboratoriais). A existência de variabilidade genética entre os isolados de um determinado patógeno é importante porque pode traduzir-se em diferenças na virulência (capacidade de infecção) ou na suscetibilidade aos agentes terapêuticos (medicamentos).
A análise das diferenças entre dois códigos genéticos complexos tem grande importância para a descoberta e a caracterização dos agentes infecciosos. Contudo, quanto maior e mais complexos os códigos genéticos, ou quanto menor a diferença entre eles, mais difícil se torna a identificação das diferenças.
Nesta pesquisa é utilizada a técnica molecular denominada Análise de Diferença Representacional (RDA), que detecta diferenças que resultam em pequenos fragmentos do código genético, presentes em uma população dos fungos e ausentes em outra.
Nessa técnica os dois códigos genéticos são simplificados, por assim dizer, em pequenos fragmentos, que podem então ser comparados. Ao ser repetida várias vezes, sobre as seqüências de DNA em estudo, a técnica amplifica as diferenças a níveis que podem ser facilmente detectados. As seqüências diferenciadas são então clonadas de modo que as diferenças existentes entre os genomas (códigos genéticos) possam ser confirmadas.
Qual a importância da pesquisa?
A importância deste trabalho para a área do conhecimento deriva do fato de abranger:
1.formação de recursos humanos especializados;
2.avanço científico na área de conhecimento;
3.caracterização dos isolados ambientais de fontes inexploradas e determinação de sua relação com os isolados clínicos; e,
4.possibilidade de desenvolvimento de testes diagnósticos mais confiáveis para C. neoformans.
O projeto vai contribuir para a formação de recursos humanos com competência em microbiologia, bioquímica e biologia molecular, aprimorando o processo de formação de pessoal e melhoria da qualidade científica na região.
Quanto ao impacto econômico e social, a elucidação de questões como a detecção de micro-epidemias (em ambientes hospitalares, por exemplo), a distinção entre re-infecção por uma nova linhagem e recidiva da infecção primária, assim como caracterização de linhagens resistentes a drogas, é importante para o re-direcionamento das terapias utilizadas.
Finalmente, uma repercussão importante da pesquisa será a implantação do teste diagnóstico proposto, no Laboratório Central do Estado (LACEN).
1.formação de recursos humanos especializados;
2.avanço científico na área de conhecimento;
3.caracterização dos isolados ambientais de fontes inexploradas e determinação de sua relação com os isolados clínicos; e,
4.possibilidade de desenvolvimento de testes diagnósticos mais confiáveis para C. neoformans.
O projeto vai contribuir para a formação de recursos humanos com competência em microbiologia, bioquímica e biologia molecular, aprimorando o processo de formação de pessoal e melhoria da qualidade científica na região.
Quanto ao impacto econômico e social, a elucidação de questões como a detecção de micro-epidemias (em ambientes hospitalares, por exemplo), a distinção entre re-infecção por uma nova linhagem e recidiva da infecção primária, assim como caracterização de linhagens resistentes a drogas, é importante para o re-direcionamento das terapias utilizadas.
Finalmente, uma repercussão importante da pesquisa será a implantação do teste diagnóstico proposto, no Laboratório Central do Estado (LACEN).
Área do Conhecimento
Ciências Biológicas
Palavras-chave – Entre 3 a 5 palavras
Cryptococcus
Neoformans
Microorganismo
Imunossuprimidos
ODS
ODS 15: Vida Terrestre
ODS 14: Vida na Água
Material Complementar
Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, Brasil, v. 20, 2001
Cryptococcus neoformans: aspectos moleculares e epidemiológicos, de Agnes Kiesling Casali, Charley Christian Staats, Augusto Schrank e Marilene Henning Vainstein.
Data da publicação do texto de divulgação
January 31, 2004